Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo / Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity

El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes métodos de conservación para actinobacterias solubilizadoras de fósforo debido a la poca información de métodos específicos reportados para estos microorganismos. Los métodos de conservación se evaluaron a 3 diferentes periodos de tiempo; largo, mediano y corto plazo, usando métodos de congelación y liofilización; arcilla, sílica, arena y transferencia periódica, respectivamente. Para ello se usaron 15 aislamientos de 3 localidades diferentes (La Vega, Maní y Tota) y un banco de referencia de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se prepararon todos los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una concentración de 10(8) cel/mL, seguido a ello se inocularon los viales de cada método de conservación con sus respectivos crioprotectantes, glicerol 20% (v/v), 30% (v/v) para congelación y skim milk 18% (p/v) para liofilización. Los métodos a mediano plazo se ejecutaron de igual manera, el inóculo se agregó a 10 perlas de arcilla, 10 g de arena y 5 g de sílica, posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se evaluó en agar avena (15 g/L). La evaluación se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer por la técnica de azul de tripán, además de la caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento en transferencia periódica. Se estableció que la actividad solubilizadora de fósforo se mantuvo más estable en los métodos de glicerol 30 % (p/v) y liofilización según el análisis estadístico.

The aim of this research was to evaluate different methods of preservation for actinobacteria with phosphate solubilization activity due to there are a few specific methods reported for these organisms. The methods were evaluated at three different time periods; long, medium and short-term and employing methods as cryopreservation and dry-freezing; clay, silica and sand; and periodically plating, respectively. Therefore 15 isolates from 3 different locations (La Vega, Maní and Tota) and a bank reference from Livestock Research Unit of the Pontificia Universidad Javeriana were used. All inocula were prepared in 0.85% saline solution (w/v) which were adjusted to a concentration of 10(8) cells/mL, followed each vial was inoculated with their respective storage cryoprotectants , glycerol 20% (v/v), 30% (v/v) to freeze and 18% skim milk (w/v) for dry-freezing. Medium-term methods were performed similarly; the inoculum was added to 10 clay beads, 10 g of sand and 5 g of silica and then stored at 4 °C. The short-term method was evaluated in oatmeal agar (15 g/L). The evaluation was performed by direct counting in a Neubauer chamberusing trypan blue staining technique, in addition to macroscopic and microscopic characterization of each isolate in periodic plating. It was established that the phosphorus solubilizing activity was more stable in glycerol 30% (w/v) and lyophilization for statistical analysis.

Evaluación de la producción de ácidos orgánicos por Streptomyces spp. y solubilización de tres fuentes de fósforo por la cepa T3A / Evaluation of organic acid production by Streptomyces spp. and solubilization of three phosphorus sources by strain T3A

Quince aislamientos de actinobacterias solubilizadoras de fósforo obtenidas a partir de suelos de los andes orientales colombianos fueron identificadas por sus características morfológicas y por la secuenciación del gen 16S ADNr. El análisis BLASTN de las 15 secuencias obtenidas mostró que los aislamientos pertenecían al género Streptomyces. Paralelamente, los aislamientos fueron sometidos a la detección de ácidos orgánicos, durante el proceso de solubilización de fósforo con la presencia mayoritaria de los ácidos oxálico, cítrico y glucónico. Dentro de las cepas evaluadas Streptomyces sp. T3A fue seleccionada para ser evaluada bajo diferentes fuentes de fósforo inorgánico debido a los resultados de evaluaciones cualitativas y cuantitativas realizadas previamente, en las cuales mostró una actividad solubilizadora de fósforo significativamente alta. Los resultados evidenciaron la capacidad de ésta actinobacteria para solubilizar diferentes fuentes de fosfatos insolubles con valores de 122 mgP·L-1 paraCa3(PO4)2, 14 mgP·L-1 para AlPO4 y 19,6 mgP·L-1 para roca fosfórica. También los ensayos revelaron que la actividad se mantiene en un rango de pH de 5 a 8 con las mismas fuentes de fosfatos evaluadas. Los resultados presentados contribuyen al avance en la caracterización de estas bacterias como promotoras de crecimiento vegetal con el fin de presentarlos como un recurso clave a nivel de biotecnología agrícola.

Fifteen isolates of Eastern Cordillera of the Colombian Andes were identified by morphological characteristics and 16S rDNA gene sequence. The BLAST analysis of 15 sequences shows that isolates belong to Streptomyes. Also we detected the organic acids in the solubilization process mainly oxalic acid, citric acid and gluconic acid. Streptomyces sp. (T3A) was selected in preliminary qualitative and quantitative assays by the high phosphorus solubilizing activity; in this work we evaluate this strain with different forms of inorganic phosphate. The results evidenced the capacity of this actinobacteria to solubilize phosphorous showed 122 mgP•L-1 Ca3(PO4)2, 14 mgP•L-1 AlPO4 and 19,6 mgP•L-1 for rock phosphate. Also the assays revealed that the activity was maintained between a pH range of 5 to 8 with the same sources of insoluble phosphates evaluated. These results contribute to characterize these strains as plant growth promotion bacteria and as key source in agricultural biotech.

Evaluación de un sistema para la micorrización in vitro en plantas demora de castilla (Rubus glaucus, Benth) / Evaluation of an in vitro mycorrhization system of blackberry plants (Rubus glaucus, Benth) / Avaliação de um sistema para micorrização in vitro em plantas de amora-preta (Rubus glaucus, Benth)

Objetivo. Obtener un sistema de micorrización in vitro en sistemas de cultivo autotrófico para plantas de mora de castilla (Rubusglaucus, Benth). Materiales y métodos. Se utilizaron esporas y fragmentos de raíces con vesículas del Hongo Formador de MicorrizaArbuscular (HFMA) Glomus sp. (GEV02). Se estableció un sistema de cultivo autotrófico para plántulas de mora, comparando dosmétodos de inoculación directa con el HFMA. Se cuantificó el número de esporas producidas, la longitud del micelio extraradical; asícomo el porcentaje de colonización del HFMA. Adicionalmente se midió la longitud aérea y radical, el peso fresco y seco de la partefoliar y radical para determinar el desarrollo de las plantas. Resultados. El sistema de cultivo autotrófico fue exitoso para plantas demora de castilla (Rubus glaucus, Benth); observándose un óptimo crecimiento de la parte aérea y radical de la planta. Adicionalmenteen este estudio se pudo obtener un sistema que permitió el desarrollo de Glomus sp (GEV02) bajo condiciones in vitro, con formaciónde estructuras típicas de la simbiosis como una buena colonización intraradical, con producción de arbúsculos y vesículas, así comoel desarrollo de micelio extraradical con hifas ramificadas y la formación de nuevas esporas. Conclusión. Las plantas de moramicropropagadas se asociaron con éxito, por primera vez, con un hongo formador de micorriza arbuscular bajo condiciones in vitro,permitiendo el desarrollo del sistema simbiótico HFMA Glomus sp., asociado a las raíces de plántulas de mora castilla micropropagadas...

Objective. Obtain an in vitromycorrhization system in autotrophic culture systems of blackberry plants (Rubus glaucus, Benth). Materials and methods. We usedspores and root fragments with vesicles of Arbuscular Mycorrhizal Fungus (AMF) Glomus sp (GEV02). We established an autotrophicculture system of blackberry plantlets comparing two methods of direct inoculation of the AMF. We measured the number of sporesproduced, the length of the extraradical mycelium as well as the percentage of colonization of the AMF. Additionally, we measuredthe shoot and root length, and the fresh and dry weight of the leaf and root parts to determine the plant development. Results. Theautotrophic culture system was successful for blackberry plants (Rubus glaucus, Benth; an optimal shoot and root growth was observed.Additionally, we obtained a system that allowed the development of Glomus sp. in in vitro conditions, with the formation of structurestypical of the symbiosis as well as a good intraradical colonization, with the production of arbuscules and vesicles, development ofextraradical mycelium with branched hyphae, and formation of new spores. Conclusion. For the first time, micropropagated blackberryplants associated successfully with an AMF under in vitro conditions, enabling the development of the symbiotic system AMF Glomussp. associated to roots of micropropagated blackberry plantlets...

Objetivo. Obter umsistema de micorrização in vitro em sistemas de cultura autotróficos para plantas de amora-preta (Rubus glaucus, Benth). Materiais emétodos. Foram usados esporos e fragmentos de raízes com vesículas do Fungo Formador Micorrízico Arbuscular (FFMA) Glomus sp.(GEV02). Foi estabelecido um sistema de cultivo autotrófico para mudas de amora-preta, comparando dois métodos de inoculação diretacom o FFMA. Foi quantificado o número de esporos produzidos, o comprimento do micélio extra radicular; bem como a porcentagemde colonização do FFMA. Além disso, foi medido o comprimento e o peso fresco e seco da parte folhar e radicular para determinar odesenvolvimento das plantas. Resultados. O sistema de cultivo autotrófico foi bem-sucedido para as plantas de amora-preta (Rubusglaucus, Benth), onde foi observado um crescimento ótimo da parte aérea e da raidicular da planta. Além disso, neste estudo foi obtido umsistema que permitiu o desenvolvimento de Glomus sp (GEV02) sob condições in vitro, com formação de estruturas típicas da simbiosecomo uma boa colonização intra radicular, com produção de arbúsculos e vesículas, assim como o desenvolvimento de micélio extraradicular com hifas ramificada e a formação de novos esporos. Conclusão. As plantas de amora-preta micropropagadas associaram-secom sucesso, pela primeira vez, com um fungo formador micorrízico arbuscular em condições in vitro, permitindo o desenvolvimentodo sistema simbiótico FFMA Glomus sp., associado às raízes das plântulas de amora-preta micropropagadas...

First record of Saprolegnia sp. in an amphibian population in Colombia / Primer registro de Saprolegnia sp. en una población de anfibios en Colombia / Primeiro registro de Saprolegnia sp. numa população de anfíbios na Colômbia

Primer registro de Saprolegnia sp. en una población de anfibios en Colombia. Objetivo. La mayoría de investigaciones en relación al declive de anfibios se han enfocado en la detección del hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis. Este es el principal patógeno detectado en el mundo. Sin embargo, otras investigaciones han demostrado la presencia de Saprolegnia ferax como un vector mortal en anfibios de Norteamérica. Este trabajo establece una posible transmisión entre especies causada por la presencia de la trucha arcoíris, sugiriendo que el declive de anfibios no solo se atribuye a la presencia de un solo patógeno, sino que puede ser causado por otros patógenos y factores. Materiales y métodos. El estudio revela la presencia de Saprolegnia sp. en la rana de los Andes Atelopus mittermeieri mediante la técnica de impronta con tinción de azul de lactofenol, que permitió la observación de las estructuras típicas de este hongo. Resultados. La importancia de este descubrimiento es la presencia de dos hongos patógenos, B. dendrobatidis y Saprolegnia, afectando simultáneamente una población de anfibios. Este hallazgo enfoca la atención en la eventual presencia de otros microorganismos que podrían estar involucrados individualmente o colectivamente en el declive de especies de anfibios. Conclusiones. Este registro sugiere una posible transmisión entre la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss), una especie introducida en las montañas de Colombia, que comparte los mismos habitats con diferentes especies de anfibios en el Santuario de Flora y Fauna de Guanentá en el alto río Fonce en la parte media de la Cordillera Oriental de Colombia...

Objective: Most research related to the decline of amphibians has been focused on the detection of the pathogenic fungus Batrachochytrium dendrobatidis. This fungus is the main pathogen detected around the world. However, research has shown the presence of another fungus, Saprolegnia ferax, as a cause of mortality in amphibians in North America. Our study suggests a possible interspecific transmission caused by the presence of rainbow trout; thus, amphibian declines may not be attributable only to the presence of a single pathogen, but to other organisms and factors. Materials and methods. Our study revealed the presence of Saprolegnia sp. in the Andean frog Atelopus mittermeieri using the imprinting technique with lactophenol blue staining, which allowed the typical structures of this fungus to be observed. Results. The importance of this discovery is the presence of two pathogenic fungi, B. dendrobatidis and Saprolegnia, which affecting simultaneously a population of amphibians. This finding brings attention to the eventual presence of other microorganisms that might be involved individually or collectively in the decline of amphibian species. Conclusions. This record suggests a possible transmission between rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), an introduced species in the highlands of Colombia, which shares the same habitats with different species of amphibians in the Sanctuary of Flora and Fauna Guanentá in the upper river Fonce in the mid Cordillera Oriental of Colombia...

Primeiro registro de Saprolegnia sp. numa população de anfíbios na Colômbia. Objetivo. A maioria das pesquisas sobre o declínio dos anfíbios tem-se centrado na detecção do fungo patogênico Batrachochytrium dendrobatidis. Este é o principal patógeno encontrado no mundo. No entanto, outros estudos têm demonstrado a presença de Saprolegnia ferax, como vetor mortal de anfíbios de América do Norte. Esta pesquisa estabelece uma possível transmissão entre espécies causada pela presença de truta arco-íris, afirmando que o declínio de anfíbios não só é atribuído à presença de um único patógeno, pudendo ser causado por outros patógenos e fatores. Materiais e métodos. A pesquisa indica a presença de Saprolegnia sp. em rãs dos Andes, Atelopus mittermeieri, pela técnica de impressão com lactofenol-azul-de-algodão, onde observou-se as estruturas típicas deste fungo. Resultados. A importância desta descoberta é a presença de dois fungos (B. dendrobatidis e Saprolegnia) que simultaneamente afetam uma população de anfíbios, concentrando a atenção na presença de outros microorganismos que podem estar envolvidos individualmente ou coletivamente no declínio das espécies de anfíbios. Conclusões. A truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), uma espécie introduzida nas montanhas da Colômbia, que compartilha o mesmo nicho ecológico com Atelopus mittermeieri, no Santuário de Flora e Fauna de Guanentá no Alto Rio Fonce no centro da Cordilheira Oriental da Colômbia, tem sido sugerida por esta pesquisa como o agente transmissor dos fungos as diferentes espécies de anfíbios...

Evaluación de actividades enzimáticas de Fusarium spp., aislados de lesiones en humanos, animales y plantas / Avaliação das atividades enzimáticas de Fusarium spp. Isolados a partir de lesões em humanos, animais e plantas / Assessment of enzymatic characterization of Fusarium spp. isolated from human, animal, and plant rounds

Objetivo. Determinar actividades amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas, pectinolíticas y proteolíticas en 32 aislamientos de Fusarium spp. de origen humano, animal y vegetal. Materiales y métodos. Las actividades enzimáticas se determinaron a nivel cualitativo, por medio de la medición de halos de hidrólisis en placas de agar con el respectivo sustrato, y a nivel cuantitativo se realizó un cultivo líquido para determinar la degradación del respectivo sustrato por medio de técnicas colorimétricas. Resultados. Todos los aislamientos presentaron actividades enzimáticas a nivel cualitativo, excepto las amilolíticas y lipolíticas. La determinación a nivel cuantitativo fue posible para las enzimas evaluadas, a excepción de las lipasas. Conclusión. La determinación de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos, pectinolíticos y proteolíticos de cada uno de los aislamientos evaluados pertenecientes al género Fusarium sugirió su capacidad, indistintamente de su procedencia, de degradar estos sustratos...

Assessment of enzymatic characterization of Fusarium spp. isolated from human, animal, and plant wounds. Objective. To determine amylolytic, cellulolytic, lipolytic, pectinolytic and proteolytic activities in 32 Fusarium spp. isolates from humans, animals and plants. Materials and methods. Qualitative determination of enzymatic activities was done by measuring hydrolysis halos in agar plates with their corresponding substrate. Quantitative determination was done by colorimetric techniques, using liquid culture supernatants to determine the respective substrate degradation. Results. All isolates showed enzymatic activities from a qualitative point of view, except amylolytic and lipolytic. Quantitative determination was possible for all the evaluated enzymes except lipases. Conclusion. The determination of amylolytic, cellulolytic, pectinolytic and proteolytic enzymatic profiles of each of the Fusarium isolates assessed suggests their capacity to degrade these substrates, irrespectively of their origin...

Avaliação das atividades enzimáticas de Fusarium spp. Isolados a partir de lesões em humanos, animais e plantas. Objetivo. Determinar as atividades amilolíticas, celulolíticas, lipolítica, pectinolíticas e proteolíticas em 32 isolamentos de Fusarium spp. de origem humana, animal e vegetal. Materiais e métodos. As atividades enzimáticas foram determinadas a nível qualitativo medindo os halos de hidrólise em placas de agar com o substrato respectivo e a nível quantitativo realizou-se uma cultura líquida para determinar a degradação do substrato respectivos por meio de técnicas colorimétricas. Resultados. Todos os isolados apresentaram uma atividade enzimática a nível qualitativo, exceto as amilolíticas e lipolíticas. A determinação a nível quantitativo foi possível para as enzimas testadas, exceto para as lipases. Conclusão. A determinação de perfis enzimáticos amilolíticos, celulolíticos, pectinolíticos e proteolíticos de cada um dos isolados testados pertencentes ao gênero Fusarium, sugeriu sua capacidade, independentemente da sua origem, para degradar estes substratos...

Evaluación de la presencia del gen mer A implicado en la detoxificación de mercurio a partir de actinomicetos nativos del humedal de La Conejera / Evaluation of the presence of mer A gen implied in the mercury detoxification from native actinomycetes of La Conejera wetland

Se aislaron diez cepas de actinomicetos nativos del humedal La Conejera a partir de muestras de sedimento y agua, con el fin de determinar la capacidad de resistencia y detoxificación de mercurio, evaluando la presencia del gen mer A involucrado en el proceso. La prueba de resistencia fue realizada mediante un test de sensibilidad tomando concentraciones desde 3,68x10-3 mM hasta 10 mM de HgCl2. Se realizaron curvas de crecimiento de 192 h para las cepas resistentes al mercurio, en un medio suplementado con 0,01 mM y 0,05 mM de HgCl2, realizando una fermentación discontinua y midiendo el crecimiento por la técnica de peso seco. A partir de estos resultados se determinó un tiempo de adaptación de 24 h y una producción máxima de biomasa de 2,72 g·L-1 a la hora 72. Paralelamente, se realizó la secuenciación de los genes de resistencia al mercurio de Streptomyces lividans 1326, por medio del diseño de los oligonucleótidos capaces de amplificar el extremos 3’ del gen mer A, codificador de la enzima mercurio reductasa. Se optimizaron las condiciones de amplificación por PCR para obtener un producto amplificado de 686 pb aproximadamente. Finalmente, se realizó una electroforesis en campo pulsado comprobando la presencia de plásmidos en la cepa KH7 con tamaños aproximados de 50, 90 y 300 Kb, no integrados al cromosoma y posiblemente asociados a la resistencia presentada frente al metal.

Ten native actinomycete strains were isolated from water and sediment samples collected in La Conejera wet-lands to assess mercury resistance and detoxification ability for evaluating the presence of the mer A gene involved in that process. Sensitivity assays were performed using 3.68 x 10-3 mM to 10 mM HgCl2 concentrations. Growth curves were generated for each resistant strain after 192 h in discontinuous fermentation in medium supplemented with 0.01 mM and 0.05 mM HgCl2. Biomass growth was then measured by dry weight, maximum value (2.37 g·L-1) being obtained after 72 h. Primer pairs were designed based on the sequence encoding the mercury-reductase enzyme in Streptomyces lividans 1326. PCR conditions for amplifying that region were standardised. The mer A gene was identified in the KH7 strain, resulting in an amplified product of around 686 bp. The KH7 strain electrophoresis profile obtained by pulsed field gel electrophoresis showed 50, 90 and 300 Kb plasmid DNA which could be related to metal resistance in this strain.

Polihidroxialcanoatos en actinomicetos nativos de suelos colombianos / Polyhydroxyalkanoate of Actinomycetes native from Colombian soils

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímetros considerados como fuente de materiales biorenovables, biodegradables y plásticos con amplios usos industriales, pero los altos costos de producción detienen su aplicación a gran escala. En el presente trabajo, fueron aisladas 10 cepas de Actinomicetos de 60 muestras de suelo rizosférico proveniente de diferentes zonas de la región de Boyacá, Colombia. Observaciones preliminares utilizando el colorante azul de Nilo permitió identificar en tres cepas la presencia de gránulos intracelulares fluorescentes del tipo PHA. Las tres cepas fueron cultivadas en dos medios para obtener cantidades significativas de PHA, encontrándose que la cepa 7F era la que presentaba una producción importante. Después de la purificación, cuantificación e identificación se determino un rendimiento del 27,48% en peso seco, lo que significa una buena productividad. Mediante pruebas bioquímicas y análisis molecular la cepa 7F fue identificada como Streptomyces subrutilus.

The polyhydroxyalkanoates (PHA) are considered as source of renewable-resource-based, biodegradable materials and plastics of a wide range industrial uses, but high production costs impede large-scale implementation. In this paper, we induced the production of polyhydroxyalkanoates (PHA) in actinomycetes isolated from Colombian soil, the microorganism with highest production and accumulation of biopolymer was isolated and identified. With Nile blue dye, we determined in three of the ten strains isolated, the presence of intracellular fluorescent granules type polyhydroxyalkanoate. The three strains were cultured for obtained significant amounts of PHA. The strain named 7F had the highest production. After purification, identification and quantification we determined a yield of 27.48% in dry weight, which means a good productivity. This strain was identified as Streptomyces subrutilus, though biochemical's reactions and Gene Bank.